Nanopolish 使用教程

1. 项目介绍

Nanopolish 是一个用于信号级分析 Oxford Nanopore 测序数据的软件包。它能够计算出改进的共识序列，检测碱基修饰，以及相对于参考基因组调用 SNPs 和 indels 等。Nanopolish 的主要功能包括：

• 计算改进的共识序列
• 检测碱基修饰
• 调用 SNPs 和 indels
• 更多功能（详见 Nanopolish 模块）

2. 项目快速启动

安装最新代码（推荐）

你可以通过以下步骤下载并编译最新代码：

git clone --recursive https://github.com/jts/nanopolish.git
cd nanopolish
make

安装特定版本

如果你希望使用特定版本，可以先检出该版本再进行编译：

git clone --recursive https://github.com/jts/nanopolish.git
cd nanopolish
git checkout v0.9.2
make

数据预处理

Nanopolish 需要访问由纳米孔测序仪测量的信号级数据。首先，你需要准备输入数据，告诉 Nanopolish 在哪里可以找到信号文件。如果你使用的是 Albacore 2.0 处理的数据，可以运行以下命令：

# 索引 basecaller 的输出
nanopolish index -d /path/to/raw_fast5s/ -s sequencing_summary.txt basecalled_output.fastq

计算新的共识序列

以下是如何为草稿基因组组装计算改进的共识序列的步骤：

# 索引草稿基因组
bwa index draft.fa

# 将 basecalled 的读取对齐到草稿序列
bwa mem -x ont2d -t 8 draft.fa reads.fa | samtools sort -o reads_sorted.bam -T reads_tmp -
samtools index reads_sorted.bam

# 使用 nanopolish 计算共识序列
python3 nanopolish_makerange.py draft.fa | parallel --results nanopolish_results -P 8 \
nanopolish variants --consensus -o polished_{}.vcf -w {} -r reads.fa -b reads_sorted.bam -g draft.fa -t 4 --min-candidate-frequency 0.1

# 合并所有 50kb 片段
nanopolish vcf2fasta -g draft.fa polished_*.vcf > polished_genome.fa

3. 应用案例和最佳实践

案例1：检测 DNA 胞嘧啶甲基化

Nanopolish 可以利用测序仪测量的信号级信息来检测 5-mC。以下是一个简单的示例：

nanopolish call-methylation -r reads.fa -b reads_sorted.bam -g reference.fa > methylation_calls.tsv

案例2：实时基因组测序

Nanopolish 在实时基因组测序中的应用，如 Ebola 病毒的监测，展示了其在公共卫生领域的潜力。

4. 典型生态项目

1. Albacore

Albacore 是 Oxford Nanopore 提供的用于 basecalling 的软件，与 Nanopolish 配合使用可以提高测序数据的准确性。

2. Canu

Canu 是一个用于长读长测序数据组装的工具，与 Nanopolish 结合使用可以生成高质量的基因组草稿。

3. BWA

BWA（Burrows-Wheeler Aligner）是一个用于将测序读取对齐到大型参考基因组的工具，是 Nanopolish 工作流程中的重要组成部分。

通过以上步骤，你可以快速上手并使用 Nanopolish 进行信号级分析，提升基因组测序数据的准确性和深度。