Minimap2中提取RNA-seq剪接位点信息的方法探究

背景概述

在RNA-seq数据分析流程中，剪接位点（splicing junction）的识别是一项关键任务。对于二代测序数据，STAR等比对工具能够直接输出剪接位点信息（如SJ.out.tab文件）。然而，当处理PacBio或Oxford Nanopore等三代长读长数据时，研究人员通常会选择minimap2进行序列比对，但该工具默认不直接提供剪接位点输出文件。

解决方案

minimap2配套工具包中提供了paftools.js实用程序，该工具包含splice2bed子命令，能够将PAF或SAM格式中的剪接比对信息转换为BED12格式。BED12格式是一种标准基因组浏览器格式，能够完整表示外显子-内含子结构。

具体实现方法

1. 比对步骤：首先使用minimap2对长读长RNA-seq数据进行比对，推荐使用-ax splice参数以优化剪接比对。

2. 格式转换：将比对结果（SAM/BAM或PAF格式）通过以下命令转换为BED12：

   paftools.js splice2bed input.sam > output.bed
   

3. 结果解读：生成的BED12文件中，每个条目代表一个转录本，其中包含：

   • 染色体位置信息
   • 转录本名称
   • 外显子边界坐标
   • 内含子区域信息

技术优势

相比直接使用STAR等工具，这种方法具有以下优势：

• 专门为长读长数据优化，能更好处理跨多个外显子的长读长
• 保留完整的转录本结构信息
• 生成的BED12格式可直接用于基因组浏览器可视化

注意事项

1. 对于大规模数据分析，建议先将SAM转换为BAM格式以提高处理效率
2. BED12文件可通过bedtools等工具进一步处理，提取特定的剪接位点信息
3. 对于定量分析，可能需要额外的处理步骤来计算剪接位点使用频率

扩展应用

该方法不仅适用于常规的剪接位点分析，还可用于：

• 新转录本发现
• 可变剪接分析
• 基因结构分析
• 转录本结构变异研究

通过这种方法，研究人员可以充分利用长读长RNA-seq数据的优势，获得更完整的转录组剪接图谱。