终极指南：如何用MitoHiFi快速组装高质量线粒体基因组？PacBio HiFi数据分析完整教程 🧬

MitoHiFi是一款强大的Python工作流，专为从PacBio HiFi测序数据中快速找到、环化和注释线粒体基因组而设计。它能有效处理线粒体DNA的异质性，生成高质量的环形化、非冗余线粒体基因组，并提供丰富的注释和覆盖度可视化结果，是线粒体基因组研究的必备工具。

MitoHiFi核心功能解析：为什么它是线粒体组装的首选工具？ 🚀

MitoHiFi v3.2.2作为最新版本，具备五大核心能力，全方位满足线粒体基因组研究需求：

✅ 双模式数据处理：从原始reads到组装contigs全覆盖

• reads模式（-r）：直接从PacBio HiFi原始reads出发，通过hifiasm组装线粒体序列
• contigs模式（-c）：从已组装的contigs中识别并提取线粒体序列

✅ 智能过滤NUMTs：精准区分核线粒体序列

通过 blast 比对和基因完整性分析，有效分离 NUMTs（核线粒体DNA序列）与真正的线粒体contigs，确保后续分析准确性。

✅ 环形化与变异分析：捕捉线粒体异质性

生成样本中所有线粒体变异体的环形化、非冗余注释版本，并提供多序列比对结果，助力线粒体异质性研究。

✅ 自动化注释与可视化：一键生成发表级图表

自动生成基因注释图（final_mitogenome.annotation.png）和覆盖度分布图（final_mitogenome.coverage.png），直观展示基因组特征。

图：MitoHiFi工作流程示意图，展示从数据输入到最终结果输出的完整流程。该图清晰呈现了线粒体reads提取、contigs筛选、环形化验证及注释的核心步骤。

✅ 多标准代表性基因组选择

基于环形化程度、基因完整性等多重标准，从多个变异体中自动选择最优代表性序列作为最终组装结果，节省人工筛选时间。

快速上手：MitoHiFi三种安装方式对比 🛠️

1️⃣ Docker/Singularity容器安装（推荐新手）

容器化安装彻底解决依赖冲突问题，一行命令即可启动：

docker pull ghcr.io/marcelauliano/mitohifi:master

singularity用户可使用：

singularity exec --bind /path/to/data docker://ghcr.io/marcelauliano/mitohifi:master mitohifi.py -h

2️⃣ Conda环境安装（适合熟悉命令行用户）

1. 克隆项目仓库：

git clone https://gitcode.com/gh_mirrors/mi/MitoHiFi

2. 创建conda环境：

conda env create -n mitohifi_env -f MitoHiFi/environment/mitohifi_env.yml

3. 安装MitoFinder和MITOS并添加到PATH：

conda activate mitohifi_env
# 确保MitoFinder和MITOS可执行文件路径已添加到系统PATH

3️⃣ 手动安装所有依赖（适合高级用户）

需安装以下软件并确保添加到PATH（推荐版本）：

• python=3.7
• samtools=1.11
• hifiasm=0.19.5
• MitoFinder=v1.4.0
• MITOS=2.1.0

详细依赖列表见 environment/mitohifi_env.yml

实战教程：MitoHiFi完整运行步骤（附测试数据） 💻

准备工作：获取参考基因组

使用内置脚本自动获取近缘物种线粒体参考基因组：

# 示例：获取Deilephila porcellus的线粒体参考序列
python src/findMitoReference.py --species "Deilephila porcellus" --outfolder ref_genome --min_length 14000

该脚本会从NCBI下载FASTA和GenBank格式的参考序列，为后续组装提供关键参考。

模式一：从原始reads开始组装（-r）

python src/mitohifi.py \
  -r tests/ilDeiPorc1.reads.100.fa \  # PacBio HiFi原始reads
  -f ref_genome/OQ694980.1.fasta \     # 参考基因组FASTA
  -g ref_genome/OQ694980.1.gb \        # 参考基因组GenBank
  -t 4 \                               # 4线程运行
  -o 5                                 # 使用无脊椎动物线粒体遗传密码

模式二：从已组装contigs开始分析（-c）

python src/mitohifi.py \
  -c tests/ilPhaBuce1_contig.fa \      # 已组装的contigs文件
  -f ref_genome/NC_072273.1.fasta \    # 参考基因组FASTA
  -g ref_genome/NC_072273.1.gb \       # 参考基因组GenBank
  -t 4 \                               # 4线程运行
  -o 5                                 # 使用无脊椎动物线粒体遗传密码

植物线粒体组装特别参数 🌱

针对植物线粒体，需添加-a plant参数：

python src/mitohifi.py -c plant_contigs.fa -f plant_ref.fasta -g plant_ref.gb -t 4 -a plant -o 11

查找叶绿体参考序列可使用：findMitoReference.py --species "Species name" -t chloroplast

关键参数调优指南：提升组装质量的7个技巧 🔧

1. blast匹配阈值（-p）：控制contigs筛选严格度

默认值为50%（推荐无脊椎动物），脊椎动物建议提高到80-90%：

# 严格筛选模式（适合脊椎动物）
python src/mitohifi.py -c contigs.fa -f ref.fasta -g ref.gb -t 4 -p 85

2. 注释工具选择：MitoFinder vs MITOS

默认使用MitoFinder，若需使用MITOS注释，添加--mitos参数：

python src/mitohifi.py -r reads.fa -f ref.fasta -g ref.gb -t 4 --mitos

3. 环形化验证参数：控制末端重叠检测

--circular-size 1000 --circular-offset 100  # 适合大型线粒体基因组

4. 覆盖度窗口大小：优化可视化效果

-winSize 500  # 调整覆盖度计算窗口大小，影响coverage.png分辨率

5. 遗传密码选择（-o）：匹配物种类型

• 无脊椎动物：-o 5
• 脊椎动物：-o 2
• 植物：-o 11
• 真菌：-o 4

6. 最大读长过滤（--max-read-len）：去除异常长reads

默认1.0x参考序列长度，可根据物种特性调整：

--max-read-len 1.2  # 允许最长为参考序列1.2倍的reads

7. 调试模式（-d）：问题诊断必备

遇到异常时启用调试模式，输出详细日志：

python src/mitohifi.py -c contigs.fa -f ref.fasta -g ref.gb -t 4 -d

MitoHiFi输出文件详解：从原始数据到最终结果 📊

核心结果文件（工作目录中）

• final_mitogenome.fasta：环形化并旋转至tRNA-Phe起始的最终线粒体基因组
• final_mitogenome.gb：GenBank格式的注释文件，包含基因位置和功能信息
• final_mitogenome.coverage.png：测序覆盖度分布图，展示基因组各区域覆盖深度
• final_mitogenome.annotation.png：基因注释可视化图，直观展示基因排列

图：MitoHiFi生成的线粒体基因组注释图（高分辨率），清晰展示各基因位置、方向及AT含量分布，可直接用于论文发表。

关键中间结果文件夹

• contigs_filtering/：blast比对结果，包含parsed_blast.txt（contigs筛选统计）
• contigs_circularization/：环形化验证结果，all_contigs.circularisationCheck.txt记录环化坐标
• potential_contigs/：所有候选线粒体contigs的单独注释结果
• coverage_mapping/：BAM文件，可用于IGV可视化验证覆盖度

完整输出文件说明见 scripts_paper/README.md

常见问题解决与最佳实践 🧩

❓ 为什么我的组装结果不是环形的？

可能原因及解决方案：

1. 数据覆盖度不足：检查coverage_plot.png，确保平均覆盖度>20x
2. 序列重复区域干扰：尝试降低-p参数（如30%）重新运行
3. 物种特异性结构：某些物种线粒体为线性，可查看contigs_circularization结果确认

❓ 如何处理线粒体异质性？

MitoHiFi自动生成all_mitogenomes.rotated.aligned.fa文件，包含所有变异体的多序列比对，可通过以下步骤分析：

1. 查看final_mitogenome_choice文件夹中的聚类结果
2. 使用MEGA或RAxML构建变异体系统发育树
3. 结合contigs_stats.tsv中的基因完整性数据综合评估

❓ Docker运行时权限问题

使用-v参数挂载数据目录时确保权限正确：

docker run -v /your/data:/data --user $(id -u):$(id -g) ghcr.io/marcelauliano/mitohifi:master mitohifi.py -h

官方资源与引用信息 📚

官方文档与脚本说明

• 完整脚本文档：docs/scripts_documentation.pdf
• 环境配置文件：environment/mitohifi_env.yml
• 测试数据：tests/

引用信息

使用MitoHiFi请引用：

MitoHiFi: a python pipeline for mitochondrial genome assembly from PacBio High Fidelity reads Marcela Uliano-Silva et al., bioRxiv 2022.12.23.521667

注释工具引用：

• MitoFinder: Allio et al., Mol Ecol Resour. 2020
• MITOS: Bernt et al., Molecular Phylogenetics and Evolution 2013

视频教程

观看详细操作讲解：https://youtube.com/watch?v=1NWHC2zkRmg

通过本指南，您已掌握MitoHiFi从安装到结果解读的全流程。无论是动物、植物还是真菌线粒体研究，MitoHiFi都能提供高效准确的分析结果，加速您的科研发现！如有问题，欢迎联系开发团队：[e-mail]