SplAdder项目文件格式详解：从输入到输出的完整指南

概述

SplAdder是一个用于分析可变剪接事件的强大工具，它能够从RNA测序数据中检测和量化各种类型的剪接变异。本文将全面解析SplAdder项目中的各类文件格式，包括输入文件要求、输出文件结构及其内容解析，帮助用户更好地理解和使用这一工具。

输入文件格式

注释文件

SplAdder接受两种标准格式的注释文件作为输入：

1. GTF格式 (Gene Transfer Format)

   • 文件扩展名必须为.gtf
   • 遵循Ensembl规范的标准格式
   • 包含基因、转录本和exon等特征信息

2. GFF格式 (General Feature Format)

   • 文件扩展名必须为.gff
   • 遵循Broad研究所或UCSC的标准规范
   • 提供基因组特征的注释信息

注意事项：SplAdder通过文件扩展名自动识别格式类型，因此必须确保文件扩展名正确无误。

比对文件

SplAdder要求所有比对文件必须符合以下规范：

• BAM格式：二进制格式的比对文件
• 遵循SAM规范：包括所有必填字段和可选字段
• 已验证兼容的比对工具：
  • STAR
  • PALMapper
  • TopHat

构建模式(build)输出文件

GFF3格式注释文件

SplAdder会生成包含检测到的剪接事件的GFF3格式文件，命名模式为： merge_graphs_<event_type>_C<confidence_level>.confirmed.gff3

文件特点：

• 每个事件表示为包含两种不同亚型的微型基因
• 采用标准GFF3格式，兼容主流基因组浏览器
• 示例内容解析（以exon skip事件为例）：

Chr1    exon_skip       gene    7616027 7616726 .       +       .       ID=exon_skip.1;GeneName="AT1G21690"
Chr1    exon_skip       mRNA    7616027 7616726 .       +       .       ID=exon_skip.1_iso1;Parent=exon_skip.1
Chr1    exon_skip       exon    7616027 7616107 .       +       .       Parent=exon_skip.1_iso1
Chr1    exon_skip       exon    7616603 7616726 .       +       .       Parent=exon_skip.1_iso1

HDF5格式事件文件

HDF5是一种高效的层次化数据格式，SplAdder使用它存储所有相关事件信息。

文件结构解析：

• 采用类似文件系统的树状结构组织数据
• 主要包含以下数据集(datasets)和组(groups)：

数据集名称	描述内容
conf_idx	确认事件的索引
confirmed	事件确认状态(二进制数组)
event_counts	三维矩阵(S×F×E)：样本×特征×事件
event_features	事件特征的描述列表
event_pos	事件exon的位置(start/stop对)
gene_chr	基因所在染色体
gene_idx	事件到基因的映射索引
gene_names	基因名称列表
gene_pos	基因位置(start/stop对)
gene_strand	基因链方向
num_verified	验证标准满足情况的计数矩阵
iso1/iso2	支持两种亚型的剪接读数
psi	剪接百分比(PSI)值矩阵
samples	样本名称列表

特征命名规则：

• 基于exon片段的编号系统
• 示例：e1e3_conf表示连接exon片段1和3的剪接比对计数
• 正链和负链的编号方向不同

各事件类型的特征定义

1. alt_3prime/alt_5prime事件：

   • 包含有效性标志、各exon片段覆盖度、剪接确认计数等

2. exon_skip事件：

   • 包含侧翼exon和跳跃exon的覆盖度、各种剪接连接确认计数

3. intron_retention事件：

   • 包含侧翼exon和保留内含子的覆盖度、剪接确认计数等

4. mult_exon_skip事件：

   • 扩展了exon_skip的特征，增加了跳跃exon数量、长度等额外信息

5. mutex_exons事件：

   • 包含四个exon片段的覆盖度和多种剪接连接确认计数

验证标准

每种事件类型都有特定的验证标准，用于确定事件在样本中是否有效：

• 多exon跳跃：exon坐标有效性、覆盖度比较、各内含子剪接计数等
• 内含子保留：保留标准、非保留计数阈值等
• exon跳跃：跳跃exon覆盖度、内含子剪接计数等
• 可变3'/5'端：差异区域覆盖度、两种可变内含子计数
• 互斥exon：两种可变exon的覆盖度、相邻内含子确认等

TXT格式事件文件

文本格式的事件文件包含与HDF5文件相同的信息，采用制表符分隔的列格式：

• 每行代表一个事件
• 包含染色体、链、事件ID、基因名等基本信息
• 后续列包含各样本的特征计数数据
• 特征定义与HDF5文件一致

测试模式(test)输出文件

文本格式结果文件

测试模式生成三种主要的文本输出文件：

1. 基本测试结果(per event)：

   • 文件名：test_results_C{C}_{ET}.tsv
   • 包含15列关键信息：事件ID、位置、基因信息、p值、dPSI值、表达量等

2. 基本测试结果(per gene)：

   • 文件名：test_results_C{C}_{ET}.gene_unique.tsv
   • 每个基因只报告最显著的事件
   • 列定义与基本测试结果相同

3. 扩展测试结果：

   • 文件名：test_results_extended_C{C}_{ET}.tsv
   • 包含基本结果的15列加上各样本的具体计数和离散度估计

诊断图表

测试模式可生成多种诊断图表（需启用--diagnose-plots选项）：

1. 计数分布图：

   • 展示测试组/条件下事件的支持计数和基因表达分布
   • 提供原始计数和对数转换版本

2. MA图：

   • 展示各事件的log2倍数变化与平均标准化计数的关系

3. 离散度图：

   • 包含原始离散度估计、离散度拟合和调整后离散度三个子图

4. QQ图：

   • 比较p值分布与均匀分布的差异
   • 可用于检测p值的过度膨胀现象
   • 提供原始和调整后p值两个版本

总结

SplAdder提供了丰富而规范的输入输出文件格式，支持从原始数据到最终分析结果的完整流程。理解这些文件格式对于正确使用SplAdder和解释其结果至关重要。HDF5格式的高效存储和文本格式的可读性相结合，既满足了大规模数据分析的需求，也方便了人工检查和结果解读。