STAR比对工具中双程模式对核糖体RNA污染读段的特殊处理机制

问题背景

在使用STAR比对工具处理Ribo-seq数据时，研究人员发现了一个值得关注的现象：当启用--twopassMode Basic参数时，大量本应比对到核糖体RNA区域的读段被错误分类为"未比对"(unmapped)状态。而在禁用该参数的标准模式下，这些读段则被正确识别为多比对(multi-mapping)读段。这一差异对数据分析结果产生了显著影响。

现象观察

在双程基础模式下，约50%的读段被标记为"未比对:其他原因"(unmapped: other)，而多比对读段仅占17%。相比之下，标准模式下多比对读段比例跃升至70%，而"未比对"读段几乎消失。

进一步分析发现，这些"消失"的读段实际上高度富集在几个特定的基因组区域(每个区域约5kb)，这些区域附近都注释有rRNA前体或假基因。这表明STAR确实能够将这些读段比对到基因组，但在双程模式下却将其排除在最终比对结果之外。

原因分析

深入研究发现，双程模式的工作机制是导致这一现象的关键：

1. 第一程比对：STAR通过约28bp长的读段识别新的剪接位点
2. 索引重建：将这些新发现的剪接位点加入比对索引
3. 第二程比对：使用更新后的索引进行最终比对

在这个过程中，核糖体RNA读段会产生大量"新"剪接位点，导致这些读段超过了STAR内置的多比对过滤器阈值(默认为20)。因此，这些读段被过滤掉并被归类为"未比对"状态。

解决方案验证

通过调整相关参数可以解决这一问题：

--twopass Basic --outFilterMultimapNmax 1000 --winAnchorMultimapNmax 2000

参数调整后，多比对读段比例恢复到67%，而"未比对"读段降至4.35%。这表明提高多比对读段的接受阈值能够使这些核糖体RNA读段重新被正确分类。

技术讨论

这一现象引发了两个重要的技术讨论点：

1. 分类准确性：当前将这些读段标记为"未比对"而非"比对到过多位点"是否合理？从技术角度看，这些读段实际上是被过滤掉的，而非真正无法比对。

2. 工作流程影响：许多主流分析流程(如nf-core的Ribo-seq和RNA-seq流程)默认启用双程模式。这种分类差异可能导致研究人员误判数据质量，甚至错误地认为样本存在严重污染。

实践建议

对于处理Ribo-seq或可能存在核糖体RNA污染的数据时，建议：

1. 比较双程模式与标准模式的比对结果差异
2. 必要时调整多比对读段的相关参数阈值
3. 特别注意检查"未比对"读段的实际来源
4. 根据研究目的决定是否保留这些读段用于后续分析

这一案例很好地展示了比对工具参数设置对数据分析结果的深远影响，也提醒研究人员需要深入理解工具的工作原理而不仅仅是使用默认参数。