HTSeq教程：使用htseq-count进行外显子水平表达量分析

引言

在RNA测序数据分析中，基因表达量定量是一个基础而关键的步骤。HTSeq工具包中的htseq-count和htseq-count-barcodes是广泛使用的工具，它们能够识别每个基因外显子区域的reads，并将reads(或read对)分配给相应的基因。然而，除了基因水平的定量分析外，有时研究人员还需要更精细的外显子水平表达量数据。本教程将详细介绍如何使用HTSeq实现外显子水平的表达量分析。

外显子水平分析的基本原理

传统上，htseq-count工具主要用于基因水平的表达量分析。它通过比对reads到基因组上的外显子区域，然后将这些reads分配给相应的基因。而当我们需要分析单个外显子的表达情况时，可以利用htseq-count的扩展功能，通过特定的参数设置来实现。

实施步骤

要运行htseq-count进行外显子水平计数，可以使用以下命令：

htseq-count -i gene_id -i exon_number --additional-attr gene_name --additional-attr exon_number

这个命令会产生一个表格，其中每一行(或列，取决于输出格式)由一个字符串geneid:exon_number标识，例如ENSG00000223972:1表示基因DDX11L1(基因ID为ENSG00000223972)的第一个外显子。表格还会包含两个额外的元数据列：基因名称和外显子编号，以方便用户使用。

输出结果解读

执行上述命令后，htseq-count会生成一个包含以下信息的表格：

1. 主标识列：gene_id:exon_number组合，唯一标识每个外显子
2. 表达量计数列：记录映射到该外显子的reads数量
3. 附加属性列：
   • gene_name：基因的常用名称
   • exon_number：外显子的编号

这种格式使得研究人员能够轻松地分析特定外显子的表达变化，而不仅仅是整个基因的表达水平。

技术注意事项

剪接带来的挑战

由于RNA剪接的存在，外显子水平的计数本质上比基因水平的计数更具噪声。典型的实验方法(如RNA-Seq)捕获的分子对应于剪接异构体或未剪接的转录本，而不是直接对应于外显子。因此，当一个read跨越外显子-外显子连接处时，外显子水平的计数器可能会产生混淆。

单端测序数据的处理

对于单端测序数据，一个跨越外显子连接处的read可能会被htseq-count视为模糊匹配。有两种处理方式：

1. 使用--nonunique=fraction选项：将read按50%-50%的比例分配给两个外显子
2. 使用--nonunique=random选项：随机将read分配给其中一个外显子

这两种方法产生的结果相似，但前者会产生浮点数结果，而后者保持整数结果。

双端测序数据的处理

对于双端测序数据，通常至少有一个mate read会落在单个外显子中，因此大多数情况下read对应应该被唯一地分配给该外显子。如果一个read被分配到一个外显子，而另一个read被分配到另一个外显子，结果取决于-m/--mode选项：

• 使用--mode=union时：read对被分配给两个外显子，视为多重映射，同样适用上述--nonunique选项
• 使用intersection模式时：脚本无法找到覆盖整个read对的单个外显子，read对被标记为__no_feature

应用价值与局限性

值得注意的是，这种计数方案并不能实现生物学上可靠的异构体计数重建。然而，它可以在标准RNA-Seq分析的基础上，用于检测特定外显子的上调或下调，适用于批量实验和单细胞实验。

外显子水平的表达分析特别适用于以下场景：

1. 研究选择性剪接事件
2. 检测外显子跳跃现象
3. 分析特定外显子的表达调控
4. 验证外显子特异性的变异影响

结论

HTSeq的htseq-count工具通过适当的参数配置，能够提供有价值的外显子水平表达量数据。虽然这种方法存在一定的技术局限性，但在许多研究场景中，它能够提供比基因水平分析更精细的表达谱信息，为深入理解基因调控机制提供了有力工具。

研究人员在使用此功能时应当充分了解其技术限制，并结合其他分析方法来验证结果。对于复杂的研究问题，可能需要考虑使用专门的异构体定量工具作为补充。