UMI-tools 使用教程

1. 项目介绍

UMI-tools 是一个用于处理 Unique Molecular Identifiers (UMIs) 和单细胞 RNA-Seq 细胞条码的工具集。UMIs 是随机分子标签，用于在 NGS 数据中识别和去除 PCR 重复。UMI-tools 提供了多种命令来处理包含 UMIs 的 fastq 文件，并在映射后进行去重和计数。

主要功能包括：

• extract: 从 fastq 读取中提取 UMIs 并将其附加到读取名称。
• whitelist: 构建真实细胞条码的白名单，适用于单细胞 RNA-Seq。
• dedup: 基于 UMIs 进行 PCR 重复的去重。
• group: 标记 PCR 重复但不删除，适用于需要手动检查重复的情况。
• count: 对每个基因的唯一分子进行计数，适用于单细胞 RNA-Seq。

2. 项目快速启动

安装 UMI-tools

使用 Conda 安装：

conda install -c bioconda -c conda-forge umi_tools

或者使用 pip 安装：

pip install umi_tools

下载测试数据

下载示例数据：

wget https://github.com/CGATOxford/UMI-tools/releases/download/v0.2.3/example.fastq.gz

提取 UMIs

使用 umi_tools extract 命令提取 UMIs：

umi_tools extract --stdin=example.fastq.gz --bc-pattern=NNNNNNNNN --log=processed.log --stdout processed.fastq.gz

映射读取

使用 Bowtie 进行读取映射：

bowtie --threads 4 -v 2 -m 10 -a mm9 <( gunzip < processed.fastq.gz ) --sam > mapped.sam

将 SAM 文件转换为 BAM 文件：

samtools import mm9.fa mapped.sam mapped.bam

对 BAM 文件进行排序和索引：

samtools sort mapped.bam -o example.bam
samtools index example.bam

去重

使用 umi_tools dedup 进行去重：

umi_tools dedup -I example.bam --output-stats=deduplicated -S deduplicated.bam

3. 应用案例和最佳实践

单细胞 RNA-Seq 数据处理

在单细胞 RNA-Seq 数据处理中，UMI-tools 可以用于去除 PCR 重复，确保数据的准确性。通过 count 命令，可以生成每个基因的唯一分子计数矩阵，用于下游分析。

基因表达定量

在基因表达定量中，UMI-tools 可以帮助去除由于 PCR 扩增引入的重复，从而提高定量的准确性。dedup 命令可以应用于映射后的 BAM 文件，去除重复读取。

4. 典型生态项目

alevin

alevin 是一个用于单细胞 RNA-Seq 数据处理的工具，与 UMI-tools 类似，它也支持 UMIs 的处理。alevin 提供了从 fastq 到计数矩阵的端到端解决方案，并且支持多重映射读取的量化。

STAR

STAR 是一个高效的 RNA-Seq 读取映射工具，可以与 UMI-tools 结合使用。在映射读取之前，可以使用 UMI-tools 提取 UMIs，然后使用 STAR 进行映射。

samtools

samtools 是一个用于处理 SAM/BAM 文件的工具集，与 UMI-tools 结合使用，可以完成从读取映射到去重的完整流程。samtools 提供了对 BAM 文件的排序、索引和查看等功能。

通过这些工具的结合使用，可以构建一个高效、准确的 NGS 数据处理流程。